二代测序技术的应用与挑战

发布时间：2024-07-25 浏览次数：136

二代测序技术的应用与挑战

测序技术是1977年由Sanger和Gilbert分别提出双脱氧链终止法和化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生。经过数十年的技术发展，2005-2007年，出现了边合成边测序或者边连接边测序的第二代测序技术，因此也叫大规模平行测序或者高通量测序（next generation sequencing，NGS）。2008年出现了以单分子测序和长读长为标志的第三代测序技术，但是由于其较高的错误率，因此距离临床广泛应用仍有一段距离。在过去近二十年的迅速发展中，NGS在无创产前筛查及诊断、肿瘤基因突变、遗传病、病原微生物、药物基因组等领域产生了重大影响。本文将从技术发展、临床应用及规范化和挑战三个方面，对NGS进行概括介绍。

1. NGS技术简介

随着人类基因组计划的完成，生命科学划时代地进入后基因组时代，使得在基因组图谱中找到疾病发生的确切机制，并实施个体化精准医疗成为可能。由于一代测序技术虽然具有长读长、准确率高的优势，但其测序成本高、耗时久、通量低等缺点导致其不能满足大规模基因组测序的需求，在人们不断探索下，Genome Sequencer20、Solexa、SOLiD等高通量测序系统陆续推出，标志着NGS技术的诞生。NGS的核心思想是边合成边测序（SBS）或边连接边测序（SBL），同时对几十万到几百万条DNA模板进行测序，具有高通量、高准确性和高度自动化的优势，被广泛的应用于临床实践中，包括实体肿瘤分析、血液肿瘤分析、遗传病和传染病分析等等，以实体肿瘤NGS靶向捕获检测为例，流程如图1所示。不同测序技术有各自的优势和不足（表一），根据应用场景选择合适的测序技术，才能充分发挥其价值。

图1 肿瘤组织样本NGS检测流程

表一不同测序技术对比

2. NGS技术临床应用

生殖健康和遗传性疾病

【主要技术路线包括：靶向测序、全基因组测序（WGS）、全外显子测序（WES）、基因组拷贝数变异测序（CNV-seq）等】

遗传致病性基因检测、无创产前DNA检测（NIPT）、胚胎植入前筛查等

肿瘤领域

【主要技术路线包括：靶向测序、WGS、WES等】

（1）辅助诊断

（2）靶向用药指导

（3）预后预测

（4）疾病监测，辅助个体化治疗方案的调整

感染性疾病

【主要技术路线包括：宏基因组测序（mNGS）、靶向测序（tNGS）等】

（1）病原体鉴定

（2）病原体分型及流行溯源

（3）耐药及毒力特征检测

药物基因组

【主要技术路线包括靶向测序、WES、WGS等】

药物代谢、敏感性和作用靶点基因变异检测，优化药物治疗

3. NGS检测规范化仍面临巨大挑战

随着近年来精准医学的发展，NGS检测方法在临床实践中发挥了重要作用，但由于其实验过程复杂、设备仪器多样和生物信息学分析软件及参数设置方面很难有完全统一的流程。尽管有《医疗机构临床基因扩增管理办法》、《分子病理诊断实验室建设指南（试行）》、《个体化医学检测质量保证指南》、《高通量测序技术临床规范化应用北京专家共识》等多项实验室建设及检测方法性能确认相关指导原则可以参考，肿瘤、遗传病和感染性疾病的病原微生物相关的NGS检测项目在规范化应用方面仍面临着巨大的挑战^[1-2]。例如：